ANALISIS PROTEIN

ANALISIS PROTEIN

A. Pre-lab

1.Bagaimana prinsip analisis kadar protein dengan metode Kjeldahl? Prinsipnya adalah pengukuran kadar protein secara tidak langsung dengan mengukur kadar N dalam sampel dengan cara destruksi, destilasi dan titrasi (Budimawaranti, 2011).

2.Mengapa analisis protein dengan metode kjedahl disebut analisis protein kasar? Karena pengukuran kadar proteinnya berdasarkan pada kadar N dalam bahan sedangkan dalam bahan untuk kadar N tidak hanya berasal dari protein. Dengan kata lain, semua komponen yang mengandung N dalam bahan akan dihitung sebagai protein. Contohnya: Asam amino, nitrit, nitrat, amonia, amida, dll (Budimawaranti, 2011).

3. Apa fungsi tahap destruksi? Tahapan destruksi berfungsi untuk melepasakan nitrogen dari protein sehingga pada akhir destruksi akan diperoleh (NH4)2SO4 dengan cara  sampel dipanaskan dalam larutan sulfat pekat, unsur C dan H teroksidasi menjadi H2O, CO2, CO dan unsur N berubah menjadi amonium sulfat atau (NH4)2SO4 (Legowo, 2005).

4.Apa fungsi tahap destilasi? Tahapan destilasi berfungsi untuk memecah amonium sulfat atau (NH4)2SO4 menjadi amonia. Prinsipnya memisahkan cairan berdasarkan perbedaan titik didih. Pada akhir destilasi indikatornya adalah apabila cairan yang ditampung dalam larutan asam bersifat asam (Legowo, 2005).

5.Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode biuret? Prinsipnya adalah mengetahui protein bahan pangan berdasarkan reaksi antara ikatan peptida dengan Cu2+ membentuk kompleks warna. Apabila bahan memiliki lebih dari satu ikatan peptida maka menghasilkan warna violet pekat dan kualitas warna akan dapat ditera pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 520 nm (Herawati, 2011).

6.Apakah terdapat perbedaan jenis protein yang terukur antara metode Kjedahl dan    Biuret? Iya, pada metode Kjehdal protein diukur berdsarkan kadar N pada bahannya, sehingga senyawa lain selain protein juga ikut terukur. Pada metode biuret, protein diukur berdasarkan jumlah ikatan peptidanya. Semakin tinggi kadar protein bahan, jumlah ikatan peptidanya juga semakin banyak. Selain itu senyawa lain yang mengandung tidak dapat terukur (Winarno, 2004).

7.Apa prinsip titrasi formol? Prinsipnya adalah menetralkan larutan dengan basa NaOH membentuk dimethilol dengan penambahan formaldehid yang mana gugus amino sudah terikat dan tidak  memengaruhi reaksi asam basa NaOH. Indikator yang digunakan adalah PP. Reaksi akhir titrasi akan terjadi perubahan warna merah muda (Herawati, 2011).

8.Apa kegunaan titrasi formol? Titrasi formol digunakan untuk menunjukkan kadar N-amino, selain itu juga dapat digunakan untuk mengukur hidrolisis protein (Herawati, 2011).

B.      Hasil dan Pembahasan

1. Kadar  Protein  Kasar  Metode  Kjedahl

No.	Nama sampel	Berat sampel (gram)	V awal (ml)	V akhir (ml)	V titer (ml)	Kadar N (%)	Kadar Protein (%)
1.	Susu UHT	1,0402	10	8,4	1,6	0,1346	0,8587
2.	Bubuk Kedelai	1,0198	50	9,1	40,9	5,535	35,31
3.	Daging Ayam	1,0740	30	8,7	21,3	2,699	15,51
4.	Blanko	1	10	9,4	0,6	-	-

Perhitungan:

1. Susu UHT

Kadar N (%)   = (V titer sampel – V titer blanko) x N HCl x 100 x 14,008         

                                                            Berat Sampel x 1000

                        = (1,6-0,6) x 0,1 x 100 x 14,008        = 0,1346 %

                                    1,0402 x 1000

Kadar Protein (%)     = %N x Fk

                                    = 0,1346 x 6,38

                                    = 0,8587 %

2. Bubuk Kedelai

Kadar N (%)   = (V titer sampel – V titer blanko) x N HCl x 100 x 14,008         

                                                            Berat Sampel x 1000

                        = (40,9-0,6) x 0,1 x 100 x 14,008      = 5,535 %

                                    1,0198 x 1000

Kadar Protein (%)     = %N x Fk

                                    = 5,535 x 6,38

                                    = 35,31 %

3. Daging Ayam

Kadar N (%)   = (V titer sampel – V titer blanko) x N HCl x 100 x 14,008         

                                                            Berat Sampel x 1000

                        = (21,3-0,6) x 0,1 x 100 x 14,008      = 2,699%

                                    1,0740 x 1000

Kadar Protein (%)     = %N x Fk

                                    = 2,699 x 6,38

                                    = 15,51 %

4. Blanko

Kadar N (%)   = (V titer sampel – V titer blanko) x N HCl x 100 x 14,008         

                                                            Berat Sampel x 1000

                        = (0,6-0,6) x 0,1 x 100 x 14,008        = 0 %

                                    1x 1000

Kadar Protein (%)     = %N x Fk

                                    =0 x 0

                                    = 0 %

                       

1. Mengapa faktor konversi pada penetapan kadar protein berbeda-beda tergantung jenis sampel?

                       

                        Karena kandungan N tiap bahan berbeda. Faktor konversi biasanya 6,25 dengan kadar N dalam protein sebesar 16%. Semakin besar kandungan atau kadar N dalam bahan maka faktor konversi semakin kecil faktor konversinya.

2. Mengapa destruksi dihentikan ketika cairan sudah jernih?

                        Karena tujuan dari proses destruksi adalaah melepaskan nitrogen dari protein. Apabila cairan sudah jernih, hal ini mengindikasikan bahwa semua nitrogen sudah terlpeas dari protein.

3. Apa fungsi K₂S₂O₄ dan HgO pada proses destruksi?

                       

                        K₂S₂O₄ dan HgO berfungsi sebagai katalisator untuk mempercepat proses destruksi dan mempertinggi titik didid asam sulfat, karena suhu yang digunakan pada proses destruksi sangat tinggi yaitu bekisar 370°C-410°C. Penambhana K₂S₂O₄ juga mencegah terjadinya ion kompleks antara amonium sulfat dengan Hg dari katalisator HgO yang terbentuk merkuri amonia sehingga membentuk amonium sulfat kompleks yang terjadi ikatannya kuat dan sukar diuapkan, HgO merupakan senyawa yang sukar dipecah dan bersifat mudah meledak.

4. Senyawa apa yang dipisahkan pada proses destilasi?

                        Pada proses destilasi amonium sulfat dipecah menjadi amonia.

 

5. Bagaimana Saudara memastikan bahwa pada proses destilasi sudah tidak ada amoniak yang menguap?

                        Hasil akhir proses destilasi diketahui setelah cairan yang ditampung dalam larutan asam bersifat asam dan berwarna jernih kekuningan.

6. Apa perbedaannya jika hasil destilasi ditampung dalam larutan HCl dengan jika ditampung dalam larutan asam borat?

           

            Jika larutan asam yang digunakan HCl, sisa asam klorida yang tidak bereaksi dengan amonia (membentuk NH₄Cl) dititrasi dengan NaOH.

            Jika larutan penampung adalah asam borat, banyaknya asam borat yang bereaksi dengan amonia dapat diketahui dengan titrasi dengan HCl 0,1 N dengan indikator MR-BCG.

7. Faktor apa yang menentukan faktor konversi suatu bahan pangan?  Berapa faktor konversi jika kadar N dalam protein adalah 15%?

                        Faktor konversi tergantung pada jenis bahan pangan, jenis protein dan kadar N dalam protein bahan.

            Faktor konversi = 100/15 = 6,67

2. Kadar  Protein  Metode  Biuret

Kurva standar

Volume standar	Konsentrasi	Absorbansi
0	0	0,028
0.1	0,125	0,04
0.2	0,25	0,035
0.4	0,5	0,041
0.6	0,75	0,059
0.8	1	0,057
1.0	1,25	0,101

Persamaan regresi linear:

         Berdasarkan kurva standar hubungan antara konsentrasi (x) dan absorbansi (y) maka akan didapatkan persamaan regresi linear sebesar y=0,047x + 0,025.

Penetapan sampel

No.	Jenis sampel	Volume akhir	Absorbansi	Konsentrasi sampel	Kadar protein (%)
1.	Susu Segar	1 ml	1,040	21,45	13,406
2.	Bubuk Kedelai	1 ml	0,496	9,494	1,989
3.	Daging Ayam	1 ml	0,466	9,315	1,344

Perhitungan:

1.      Susu Segar

Konsentrasi sampel

y               = 0,047x + 0,025

1,040        = 0,047x + 0,025

x               = (1,040-0,025)/0,047            = 21,45

Fp sampel

Fp             =  V sampel + V pengenceran        = (0,4 + 0,6)/0,4        =2,5

                             V sampel                                           

% Protein

% Protein            = X sampel x Fp x V akhir  x 100% =(21,45 x 2,5 x 1)/400= 13,406%

                             gr sampel x 1000

                

2.      Bubuk Kedelai

Konsentrasi sampel

y                = 0,047x + 0,025

0,496         = 0,047x + 0,025

x                = (0,496-0,025)/0,047            = 9,949

Fp sampel

Fp              =  V sampel + V pengenceran        = (3 + 15)/3   = 6

                              V sampel                                           

% Protein

% Protein = X sampel x Fp x V akhir  x 100% =(9,949 x 6 x 1)/300= 1,948%

                              gr sampel x 1000

3.      Daging Ayam

Konsentrasi sampel

y                = 0,047x + 0,025

0,466         = 0,047x + 0,025

x                = (0,466-0,025)/0,047            = 9,315

Fp sampel

Fp              =  V sampel + V pengenceran        = (3 + 10)/3   =4,33

                              V sampel                                           

% Protein

% Protein = X sampel x Fp x V akhir  x 100% =(9,315 x 4,33 x 1)/300= 1,344%

                              gr sampel x 1000

1. Apa jenis protein yang terukur dengan metode Biuret?

     

                        Protein yang terukur pada metode biuret adalah protein yang larut air (protein terlarut), karena yang diukur adalah jumlah ikatan peptida dalam protein, maka tidak dapat mendeteksi nitrogen dari senyawa non peptida sehingga yang terukur adalah protein sesungguhnya.

2. Apa fungsi penambahan TCA pada analisis protein dengan metode Biuret?

                       

                        Untuk mengendapkan protein dalam bahan.

           

3. Apa fungsi penambahan dietil eter?

                        Untuk melarutka lemak dalam bahan dan untuk menghilangkan sisa asam trikarboksilat (TCA).

Perbandingan Metode

Jelaskan untuk setiap jenis sampel, mengapa terdapat perbedaan kadar protein antara metode Kjedahl dan Biuret!

Sampel	Kadar Protein (%)		Penjelasan
	Metode Kjedahl	Meode Biuret
Susu Segar	0,8587	13,406	Metode biuret cocok untuk protein yang larut dalam air seperti susu segar, dengan menggunakan metode biuret maka akan lebih mendeteksi kandungan protein lewat ikatan peptida yang terbenuk dengan Cu2+. Selain itu terdapat sedikit senyawa penggangu yang memudahkan untuk menganalisis protein dengan menggunakan metode biuret jika dibandingkan dengan metode kjedahl. Selain itu, absorbansi yang dihasilkan dari metode biuret lebih tinggi dikarenakan sangat mudah menyerap cahaya.
Bubuk Kedelai	35,31	1,989	Perbedaan ini terjadi karena pada metode kjedahl yang dianalisis adalah protein kasar sehingga semua unsur N yang ada diangggap sebagai protein sehingga kadar protein pada metode kjedahl nilainya sangat tinggi.
Daging ayam	15,51	1,344	Menurut teori, protein jika dianalisis dengan menggunakan metode kjedahl yang terdeteksi adalah protein kasar artinya semua unsur N akan dianggap sebagai protein sehingga jika dbandingkan metode metode kjedahl akan menyumbangkan protein lebih banyak.

3. Kadar  N-Amino (Cara Titrasi Formol)

No	Jenis sampel	Volume titrasi	% N-Amino	% Protein
1.	Blanko	0	-	-
2.	Susu Segar	0,2	0,0090	0,0574
3.	Bubuk Kedelai	0,4	0,0185	0,11803
4.	Daging Ayam	0,4	0,0186	0,12555

Perhitungan:

1. Blanko

%N      =          titrasi formol x N NaOH x 14,008

                        gr bahan x 10

            =          0

% Protein       = 0

2. Susu Segar

%N      =          titrasi formol x N NaOH x 14,008

                        gr bahan x 10

            =          0,2 x 0,1 x 14,008       = 0,009%

                        3,1010 x 10

%Protein        = %N x F konversi

                        = 0,009 x 6,38 = 0,00574 %

3. Bubuk Kedelai

%N      =          titrasi formol x N NaOH x 14,008

                        gr bahan x 10

            =          0,4 x 0,1 x 14,008       = 0,0185%

                        3,0176 x 10

%Protein        = %N x F konversi

                        = 0,0185 x 6,38 = 0,11803%

4. Daging Ayam

%N      =          titrasi formol x N NaOH x 14,008

                        gr bahan x 10

            =          0,4 x 0,1 x 14,008       = 0,0186%

                        3,0115 x 10

% Protein       = %N x F konversi

                        0,0186 x 6,75 = 0,12555%

1. Apa fungsi penambahan formaldehida?

                        Untuk membentuk dimethilol sehingga formaldehid akan bereaksi dengan gugus amino dari protein atau asam amino membentuk dimethilol.

2. Mengapa titrasi dilakukan dengan menggunakan NaOH?

                        Agar protein tidak bersifat asam, karena gugus karboksil yanga terbentuk pada metode titrasi formol bersifat asam. Oleh karena itu, hal ini dilakukan titrasi dengan NaOH sebagai titran agar tercapai kondisi ekuivalen dari larutan. Dengan mengetahui jumlah NaOH yang diapakai (untuk titrasi) maka hidrolisis protein meningkat.

3. Bagaimana tingkat hidrolisis protein dapat ditunjukkan oleh titrasi formol?  Apakah semakin tinggi %N hasil titrasi formol, tingkat hidrolisis semakin tinggi? Jelaskan!

                        Tingkat hidrolisis protein dapat ditunjukkan ddengan senyawa yang mengikat N-amino pada sampel maka gugus aktiif akan diikat oleh naOH pada titrasi.

                        Iya, karena apabila %N  hasil titrasi formol semakin tinggi maka jumlah gugus karboksil bebas juga semakin banyak. Hal ini berarti akan meningkatkan tingkat hidrolisis protein.

Perbandingan Metode

Dari metode analisis protein dan tingkat hidrolisis protein, metode mana (Ö) yang paling tepat digunakan untuk sampel berikut.  Jelaskan alasannya

Sampel	Kadar Protein (%)			Penjelasan
	Metode Kjedahl	Meode Biuret	Titrasi Formol
Susu Segar	0,8587	13,406 (v)	0,0574	Dari data hasil didapatkan kandungan tertinggi terdapat pada metode biuret hal ini dapat disebabkan karena pada metode ini sedikit senyawa penggangu dan sangat mudah menyerap cahaya sehingga nilai absorbansinya sangat tinggi. Jika dibandingkan dengan metode Kjedahl,pada metode titrasi formol hanya sedikit kadar protein yang memungkinkan sedikitmya hidrolisis protein pada susu.
Bubuk Kedelai	35,31 (v)	1,989	0,11803	Dari data hasil didapatkan kandungan protein pada metode kjedahl lebih tinggi dibandingkan dengan kedua metode. Hal ini disebabkan karena pada metode ini yang dianalisis adalah protein kasar yang menganggap semua unsur N merupakan unsur protein.
Daging Ayam	15,51 (v)	1,344	0,12555	Dari data hasil dapat terlihat pada metode Kjedahl kadar protein lebih tinggi. Menurut teori kadar protein pada metode kjedahl memang lebih tinggi sebab metode ini dapat menganalisis semua unsur yang mengandung N dianggap sebagai protein jika dibandingkan metode biuret.   Kesalahan dapat terjadi disebabkan oleh beberapa faktor.

ANALISA PROSEDUR

1.      Metode Kjedahl

     Ada beberapa prosedur atau tahapan pada analisis protein dengan metode Kjedahl. Pertama yaitu persiapan alat dan bahan yang akan digunakan diantaranya sampel berupa susu segar, bubuk kedelai dan daging ayam, serta akuades sebagai blanko atau variabel kontrol. Selanjutnya sampel cair dan bubuk ditimbang sebanyak 1 gram dengan menggunakan timbangan analitik. Sedangkan sampel daging ayam dihancurkan terlebih dahulu dengan menggunakan mortar untuk memperkecil ukuran, lalu ditimbang sebanyak 1 gram. Selain itu, timbang K₂SO₄ 10 gram dan CuSO₄ 0,25 gram sebanyak 4 kali.

     Tahapan pertama yaitu destruksi. Sampel dimasukkan ke dalam masing-masing labu Kjedahl dan ditambahkan K₂SO₄ dan CuSO₄ yang berfungsi sebagai katalisator yang mempercepat reaksi. Kemudian labu Kjehdal dibawa ke lemari asam untuk ditambahkan H₂SO₄ pekat 20 ml yang bertujuan untuk mendestruksi protein menjadi unsur-unsurnya. Penambahan dilakukan di lemari asam untuk menghindari unsur S di dalam protein terurai menjadi SO₂ yang sangat berbahaya. Selain itu, juga ditambahkan batu didih yang berguna untuk mencegah letupan yang dihasilkan saat pemanasan. Selanjutnya dimasukkan ke dalam alat destruksi dan dipanaskan pada suhu 600°C selama 90 menit sampai cairan jernih. Kemudian didinginkan di lemari asam dan ditambahkan akuades 25 ml di luar lemari asam. Akan terjadi reaksi yang menghasilkan panas pada labu Kjedahl. Oleh karena itu, ditunggu sampai dingin.

     Tahapan kedua yaitu destilasi. Disiapkan larutan asam borat 50 ml dan 4 tetes indikator Kjedahl ke dalam masing-masing 4 buah erlenmeyer. Kemudian pasang erlenmeyer pada tempat hasil destilasi, pastikan ujung selang tercelup dalam larutan asam borat dan sampel dipasang pada tempat destilasi. Kemudian ditambahkan reagen NaOH 30% sampai berubah warna coklat. Penambahan NaOH berfungsi untuk memberikan suasana basa, karena protein tidak dapat optimal pada suasana asam. Kemudian diatur waktunya selama 3 menit. Lakukan hal tersebut pada ketiga sampel dan blanko. Kemudian hasil destilasi (destilat) pada erlenmeyer didinginkan dan ditutup menggunakan aluminum foil.

     Tahapan ketiga yaitu titrasi dengan menggunakan HCl 0,1 N sebagai titran. Titrasi blanko dan sampel dengan HCl perlahan-lahan sampai warna berubah menjadi merah muda. Kemudian dihitung perubahan volume HCl yang digunakan untuk titrasi dan hitung persentase kadar N dan kadar protein sampel dengan menggunakan rumus.

2.      Metode Biuret

     Pada analisa protein dengan  menggunakan metode biuret, pertama adalah persiapkan alat dan bahan yang akan digunakan yaitu sampel padat dan cair yang diuji adalah susu segar, bubuk kedelai dan daging ayam. Untuk sampel padat dihancurkan terlebih dahulu dengan menggunakan mortar untuk memperkecil ukuran. Kemudian sampel daging dan bubuk kedelai ditimbang 3 gram dengan menggunakan timbangan analitik, sedangkan susu segar diambil sebanyak 0,4 ml dengan menggunaka pipet volum. Lalu sampel ditambahkan akuades sebanyak 10 ml untuk daging ayam, 15 ml untuk bubuk kedelai, dan 0,6 ml untuk susu segar. Akuades sebagai pelarut polar berfungsi untuk melarutkan protein yang larut dalam air. Kemudian sampel dicampur dan disaring dengan menggunakan kertas saring whatman dimasukkan tabung reaksi. Kemudian sampel dipindahkan ke dalam tabung tube dengan ukuran yang sama untuk semua sampel. Dilanjutkan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit untuk memisahkan supernatan dan endapan pellet. Setelah itu, untuk sampel daging dan bubuk kedelai didapatkan supernatan, sedangkan sampel susu cair didapatkan  endapan lalu ditambahkan 2 ml etil eter yang berfungsi untuk melarutkan lemak dalam susu dan dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk didapatkan endapan kering dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian untuk sampel daging dan bubuk kedelai diambil 1 ml supernatan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Lalu semua sampel ditambahkan akuades, 4 ml untuk sampel susu segar sedangkan 3 ml untuk sampel daging dan bubuk kedelai. Kemudian ketiga sampel ditambahkan 6 ml biuret sebagai indikator dan ditunggu selama 30 menit atau inkubasi yang berfungsi untuk memberikan waktu pada reagen biuret untuk bereaksi dengan protein sampel. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 520 nm dengan spektrofotometer.

     Di sisi lain juga dibuat larutan standar. Pertama, kasein ditimbang sebanyak 20 mg lalu ditambahkan akuades sebanyak 5 ml, kemudian dicampur sampai benar-benar larut. Selanjutnya dimasukkan ke dalam 7 tabung reaksi, masing-masing berisi 0 ml, 0,1 ml, 0,2 ml, 0,4 ml, 0,8 ml, dan 1 ml. Lalu ditambahkan akuades sampai larutan tersebut menjadi sebanyak 4 ml. Kemudian ditambahkan reagen biuret sebagai indikator sebanyak 6 ml dan ditunggu selama 30 menit untuk memberikan waktu pada reagen biuret untuk bereaksi dengan protein (kasein). Kemudian diukur absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 520 nm dan hasilnya di plotting untuk didapatkan kurva dan persamaan regresi linear dari standarnya.

3.      Metode Titrasi Formol

     Pertama sampel padat yaitu daging ayam dihancurkan dengan mortar untuk memperkecil ukuran dan sampel cair serta bubuk kedelai ditimbang sebanyak 3 gr dengan menggunakan timbangan analitik. Kemudian maisng-masing sampel dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan akuades sampai tanda batas. Lalu digojok atau di homogenisasi beberapa kali. Selanjutnya diambil 10 ml dipindahkan ke erlenmeyer. Di sisi lain juga dibuat larutan blanko yaitu akuades sebagai standar sebanyak 10 ml ke dalam erlenmeyer. Kemudian masing-masing erlenmeyer ditambahkan akuades sebanyak 20 ml, 1 ml indikator PP dan 0,4 ml kalsium oksalat. Kemudian masing-masing erlenmeyer ditiotrasi oleh NaOH, pastikan titrasi pertama yaitu larutan standar, sehingga perubahan warna yang dihasilkan menyeseuaikan larutan standar

PEMBAHASAN

1.      Prinsip

            Ada beberapa metode dalam analisa protein, diantaranya metode Kjedahl, metode biuret, dan metode titrasi formol. Prinsip dari metode Kjedahl adlah mengukur kadar protein secara tidak langsung dengan cara mengukur kadar N dari sampel melalui 3 tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Sementara itu, untuk metode biuret prinsipnya adalah menentukan kadar protein yang didasarkan pada pengukuran serapan cahaya berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret. Dimana yang membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu²⁺ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Sedangkan prinsip titrasi formol adalah larutan filtrat yang mengandung protein dinetralkan dengan basa NaOH. Kemudian ditambahkan formalin yang akan bereaksi dengan gugus amin dari protein membentuk dimethilol yang akan mengikat gugus amin, sehingga tidak akan memengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Gugus karboksil berikatan dengan NaOH sampai titik akhir titrasi gugus karboksil dari asam amino akan ditetesi dengan NaOH sampai titik akhir titrasi membentuk warna merah muda permanen dengan indikator PP atau fenoltalein.

1.      Reaksi

Berikut ini reaksi yang terjadi pada analisa protein metode Kjedahl:

• Tahapan Destruksi: Proses pengubahan protein menjadi amonium sulfat. Fungsi asam sulfat pekat yaitu mendestruksi protein menjadi unsur-unsurnya menghasilkan CO₂, H₂O, SO₂ sebagai hasil reduksi.
• Tahapan Destilasi: Memisahkan cairan/ larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Pada tahap ini amonium sulfat dipecah menjadi amonia. Hasil destilasi (destilat) ditangkap oleh asam borat yang terdapat dalam erlenmeyer dan membentuk senyawa (NH₄)₃BO₃(Achmad, 2011)
• Tahapan Titrasi: Banyaknya asam borat yang bereaksi dengan amonia dapat diketahui dengan volume HCl yang dibutuhkan destilat.

Berikut ini reaksi yang terjadi pada analisa protein metode Biuret:

Pada metode biuret terjadi reaksi antara protein dengan ion Cu²⁺ membentuk kompleks berwarna ungu dalam pereaksi reagen biuret dengan pengukuran daya serapan cahaya berwarna ungu menggunakan alat spektrofotometer.

Berikut ini reaksi yang terjadi pada analisa protein metode Titrasi formol:

Pada metode analisa protein dengan metode titrasi formol yaitu larutan filtrat yang mengandung protein dinetralkan dengan menggunakan larutan basa NaOH. Kemudian ditambahkan dengan formalin membentuk dimethilol. Dimethilol tersebut akan mengikat gugus amin pada protein sehingga tidak dapat memengaruhi reaksi asam karboksil dengan basa NaOH serta dapat diketahui titik akhir titrasi dengan tepat sampai berwarna merah muda permanen dengan indikator Fenolftalein atau PP.

1.      Perbandingan data dengan literatur

            Berdasarkan data hasil pengamatan pada analisis protein dengan metode Kjedahl didapatkan hasil kadar protein sampel susu segar sebesar 0,8587%, bubuk kedelai 35,31%, dan daging ayam sebesar 15,51%. Sementara itu, metode biuret didapatkan hasil pada sampel susu segar sebesar 13,406%, bubuk kedelai 1,989%, dan daging ayam 0,1803%. Sedangkan, pada metode titrasi formol didapatkan hasil kadar protein pada susu segar sebesar 0,0574%, bubuk kedelai 0,11803%, dan daging ayam sebesar 0,12555%. Berdasarkan Legowo (2005) didapatkan nilai kadar protein dari susu ssapi 3,2%, bubuk kedelai sebesar 34,9%, dan daging ayam sebesar 18,2%. Dapat disimpulkan bahwa kadar protein yang hampir mendekati kisaran berdasarkan literatur pada sampel susu segar yaitu dengan metode biuret, karena metode ini cocok untuk protein yang terlarut dalam air. Selain itu, pada metode tersebut, susu segar memiliki kemampuan yang besar dalam menyerap cahaya, sehingga nilai absorbansi yang tertera pada alat spektrofotometer juga besar. Sementara itu, bubuk kedelai yang memiliki nilai kadar protein yang mirip dengan literatur yaitu kadar protein bubuk kedelai dengan metode Kjedahl yaitu dengan   nilai 35,31%. Sedangkan untuk nilai kadar protein daging ayam yang sesuai dengan literatur yaitu dengan metode Kjedahl dengan nilai 15,51%. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa susu segar cocok dianalisis kadar proteinnya dengan menggunakan metode Biuret, bubuk kedelai cocok dianalisis kadar proteinnya dengan metode Kjedahl, dan daging ayam cocok menggunakan metode Kjedahl yang dapat mengukur kadar protein secara kasar sehingga semua yang mengandung N dapat terukur sebagai protein.

2.      Faktor-faktor yang memengaruhi data hasil pengamatan

            Ada beberapa faktor yang memengaruhi data hasil pengamatan analisa protein dengan beberapa metode yaitu metode Kjedahl, metode biuret, dan metode titrasi formol.

1. Karakteristik Sampel
2. Jenis Sampel
3. Ukuran Sampel
4. Banyak sedikitnya kadar protein dalam sampel
5. Jenis atau metode analisis yang digunakan
6. Reagen yang digunakan
7. Suhu atau perlakuan panas
8. Jenis protein yang terkandung dalam sampel
9. Tidak adanya inhibitor.

                                                                        (Selvy, 2011)

KESIMPULAN

            Berdasarkan praktikum analisa kadar protein dengan menggunakan 3 metode, yaitu metode Kjedahl, biuret, dan titrasi formol maka dapat disimpulkan sebagai berikut:

1. Prinsip reaksi

            Prinsip dari metode Kjedahl adalah mengukur kadar protein secara tidak langsung dengan cara mengukur kadar N dari sampel melalui 3 tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Prinsip metode biuret adalah menentukan kadar protein yang didasarkan pada pengukuran serapan cahaya berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret. Dimana yang membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu²⁺ yang terdapat dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Sedangkan prinsip metode titrasi formol adlah larutan filtrat yang mengandung protein dinetralkan dengan basa NaOH, kemudian ditambah formalin yang akan bereaksi dengan gugus amin dari protein membentuk dimethilol. Dimethilol akan mengikat gugus amin, sehingga tidak memengaruhi reaksi antara asam karboksil dan basa NaOH sehingga titik akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat membentuk warna merah muda permanen dengan indikator PP.

2. Kecocokan metode untuk sampel yang digunakan

                        Untuk sampel susu segar cocok menggunakan analisa kadar protein dengan metode biuret, karena merupakan protein yang larut dalam air dan memiliki daya serap cahaya yang sangat tinggi sehingga menghasilkan nilai absorbansi yang tinggi juga. Sedangkan pada sampel bubuk kedelai dan daging ayam cocok menggunakan metode Kjedahl, karena nilai kadar proteinnya mendekati kadar protein yang ada pada literatur.

Daftar Pustaka

Achmad, Nurdin. 2011. Reaksi Analisa protein. Jakarta: UI Press

Budimawaranti. 2011. Komposisi dan Nutrisi pada Susu Kedelai. Yogyakarta: FMIPA UNY

Handayani, hanik. 2011. Laporan Praktikum Analisa Protein. http://www.hanablo.blogspot.com diakses tanggal 29 Maret 2014 pukul 16.35

Herawati, Rina. 2011. Analisis Makanan. Yogyakarta: UNY

Legowo, A. Analisis Pangan. 2005. Semarang: Badan Penerbit Universitas Diponegoro.

Selvy, Fransisca. 2011. Laporan Praktikum.  www.scribd.com diakses pada tanggal 29Maret 2014 pukul 16.45 WIB

Winarno, F.G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama