Ekstraksi dan Pengujian Aktivitas Amilase

EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE

Pre Lab

1.      Mengapa enzim amilase bisa didapatkan pada kecambah biji-bijian?

Karena pada kecambah biji-bijian terdapat atau memiliki enzim amilase (enzim ini akan aktif setelah terjadi proses imbibisi atau penyerapan air). Enzim ini dibutuhkan untuk menghidrolisis pati menjadi maltosa, kemudian maltosa dihidrolisis oleh enzim maltase menjadi glukosa. Proses katabolisme ini ditujukan untuk pertumbuhan kecambah (Suarni, 2007).

2.      Jelaskan prinsip pengukuran aktivitas enzim amilase secara kuantitatif pada percobaan ini?

Prinsipnya adalah enzim amilase dari kecambah biji-bijian, dimana aktivitas enzim ini ditunjukkan dari perubahan warna menjadi bening akibat proses hidrolisis pati oleh enzim tersebut (Bergmeyer, 2010).

3.      Bagaimana cara mengidentifikasi secara kualitatif bahwa telah terjadi reaksi enzimatis pada percobaan ini?

Caranya adalah dengan terjadinya perubahan warna dari biru menjadi bening. Memudarnya warna biru menjadi bening tersebut dapat mengindikasikan bahwa warna biru pada pati (setelah ditambahkan iodin) akan terhidrolisis oleh enzim amilase menjadi bening (Muljoharjo, 2008).

Hasil dan Pembahasan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, ada beberapa tahapan atau prosedur dalam mengekstraksi dan menguji aktivitas enzim amilase. Tahapan pertama yaitu  persiapan sampel, ada 50 gr biji kacang hijau. Lalu ditimbang masing-masing 10 gr untuk mendapatkan perlakuan 10 gr biji kering (tanpa perlakuan), 10 gr direndam selama 12 jam, 10 gr dikecambahkan selama 12 jam, 10 gr dikecambahkan 24 jam dan 10 gr dikecambahkan selama 48 jam.

Tahapan selanjutnya yaitu ekstraksi enzim amilase. Dari 10 gr sampel tersebut, dihancurkan dengan menggunakan alat mortar untuk mengeluarkan enzim amilase yang merupakan endoselluler. Kemudian ditimbang sebanyak 5 gr dengan timbangan analitik lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan larutan buffer asetat (0,1-0,5 M) pH 5,5 untuk menstabilkan pH agar netral karena enzim tidak dapat bertahan pada pH yang terlalu tinggi ataupun terlalu rendah. Lalu didiamkan selama 30 menit dan sesekali diaduk. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan pada saat ekstraksi enzim. Kemudian disaring dengan kertas saring whatman untuk memisahkan ampas dengan filtrat. Kemudian diambil 15 ml filtrat ditambahkan 15 ml larutan buffer asetat dan dimasukkan kedalam tabung bertutup. Selain itu, larutan blanko yang terdiri dari pencampuran 50 ml akuades dan 50 ml buffer asetat dimasukkan ke dalam tabung bertutup sebanyak 15 ml dan ikut disentrifugasi. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatann 1500 rpm selama 30 menit. Sehingga hasil akhirnya berupa supernatan yang berada di atas permukaan dan terdapat endapan yang disebut pellet.

Langkah selanjutnya yaitu pembuatan substrat pati. Diambil 1 ml larutan soluble starch dengan menggunakan pipet volum dan dimasukkan ke dalam gelas beker. Kemudian ditambahkan air sebanyak 100 ml, lalu diaduk dan dipanaskan diatas kompor listrik sampai jernih dan homogen, sehingga didapatkan hasil yaitu substrat pati yang siap untuk digunakan analisis aktivitas enzim amilase.

Kemudian dilakukan pengukuran aktivitas enzim hasil ekstraksi. Diambil 1 ml enzim hasil ekstraksi dan ditambahkan 1 ml larutan substrat pati yang dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Di sisi lain juga diambil 1 ml larutan blanko dan 1 ml larutan pati yang di masukkan ke dalam tabung reaksi. Kedua tabung reaksi tersebut diinkubasi pada shaker waterbath selama 3 menit dengan suhu optimum 30°C. Hal tersebut dilakukan untuk menghomogenkan dan mempercepat reaksi enzimatis antara substrat pati oleh enzim amilase diubah menjadi maltosa. Setelah diinkubasi, ditambahkan reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) sebanyak 2 ml dengan menggunakan pipet volum. Lalu dipanaskan pada air mendidih. Hal ini bertujuan untuk mempercepat reaksi antara reagen DNS dengan maltosa sebagai gula perduksi yang akan mereduksi DNS sehingga terjadi perubahan warna kuning menjadi merah jingga. Lalu didinginkan cepat dengan dialirkan pada air kran. Hal ini berfungsi untuk mempercepat proses pendinginan sebelum pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer. Kemudian sampel dan blanko tersebut masing-masing dituangkan ke dalam gelas beker lalu ditambahkan 20 ml akuades. Kemudian diaduk dan dimasukkan sampel ke dalam masing-masing kuvet untuk pembacaan absorbansi oleh spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Kemudian dibuat kurva standar dan kurva sampel dengan plotting regresi linear. Sehingga dengan menggunakan rumus aktivitas enzim α-amilase = C x 1/T x 1 unit/1 mikromol didapatkan hasil pengukuran aktivitas enzim tiap-tiap sampel.

Berdasarkan data hasil pengamatan terdapat 2 kurva yaitu kurva standar dan kurva sampel. Kurva standar didapatkan dari plotting hubungan antara konsentrasi standar maltosa dalam satuan ppm yaitu 0, 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 dengan nilai absorbansi berurut-urut 0,13, 0,166, 0,205, 0,216, 0,243, 0,243, 0,243, dan 0,256. Dari hasil plotting tersebut didapatkan persamaan regresi linear yaitu y=0,0204x+0,127. Mengacu pada persamaan tersebut didapatkan nilai x atau C (konsentrasi maltosa ekstrak enzim dalam ppm) dengan memasukkan nilai y sebagai absorbansi tiap sampel yaitu 0,154, 0,068, 0,093, 0,134, dan 0,149. Sedangkan kurva sampel didapatkan dari hubungan antara x (konsentrasi sampel) dan y (absorbansi sampel), sehingga menghasilkan persamaan regresi linear y=0,02x+0,126. Apabila dibandingkan antara kurva sampel dengan kurva standar, dilihat dari persamaan regresi linear yang didapatkan tidak berbeda nyata. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa data hasil pengamatan sampel sudah sesuai dengan standar baku yang telah ditetapkan.

Sementara itu, reagen yang digunakan pada percobaan ini, salah satunya adalah reagen DNS (3,5 dinitro salicilic acid) yang berfungsi sebagai pendeteksi adanya gula pereduksi pada sampel (disakarida: maltosa yang merupakan hasil hidrolisis pati oleh enzim amilase). Oleh karena itu, reagen DNS sangat penting peranannya dalam menentukan aktivitas enzim amilase. Reagen DNS sebagai oksidator akan tereduksi oleh gula pereduksi yaitu maltosa menjadi asam-3-amino-5-dinitro salisilat dan terjadi perubahan warna kuning menjadi merah jingga. Oleh karena itu semakin pekat warna yang dihasilkan maka semakin banyak gula pereduksi yang terkandung. Gula pereduksi ini dihasilkan dari proses hidrolisis oleh enzim amilase. Oleh karena itu, semakin besar aktivitas enzim amilase maka semakin banyak reagen DNS yang tereduksi oleh gula pereduksi dan perubahan warna menjadi merah jingga semakin pekat.

Berdasarkan data hasil pengamatan yang telah dilakukan, didapatkan aktivitas enzim amilase pada biji kering sebesar 0,4412 unit/mikromol , biji yang direndam selama 12 jam sebesar -0,9641 unit/mikromol, biji yang dikecambahkan selama 12 jam sebesar -0,5556 unit//mikromol, biji yang dikecambahkan selama 24 jam sebesar 0,1144 unit/mikromol, dan biji yang dikecambahkan selama 48 jam sebesar 0,3595 unit/mikromol. Sehingga apabila diurutkan dari yang terkecil sampai yang terbesar aktivitas enzim amilase-nya yaitu biji direndam 12 jam < biji dikecambah 12 jam < biji dikecambah 24 jam < biji yang dikecambah 48 jam < biji kering.

Pada uji aktivitas enzim amilase untuk biji kacang hijau kering memiliki nilai aktivitas enzim yang lebih besar dibanding biji kacang hijau yang mengalami proses penyerapan air (imbibisi). Padahal menurut Suarni (2007) pada ekstrak biji kacang hijau kering masih dalam masa dorman atau masa istirahat sehingga enzim amilase belum aktif. Selain itu proses penyerapan air pada perkecambahan biji mempunyai aktivitas utama untuk mengaktifkan makromolekul dan organel sel dalam biji. Selama proses perkecambahan sebagian besar enzim dalam biji menjadi aktif diantaranya enzim α-amilase. Terdapat ketidakcocokan data hasil pengamatan dengan literatur yang ada, menurut tim penyusun buku petunjuk praktikum biokimia dan enzimologi (2006) disebabkan karena saat penghancuran biji, enzim dalam biji kering yang didapatkan lebih besar daripada biji yang direndam, sehingga ketika diberi akuades enzimnya aktif atau keberadaan kofaktor atau koenzim yang membantu kerja enzim. Selain itu, konsentrasi enzim tiap perlakuan berbeda tegantung  dari proses ekstraksi enzim.

Sementara itu pada uji aktivitas enzim amilase beberapa sampel bernilai negatif, yaitu niji direndam 12 jam dan biji dikecambahkan 12 jam. Nilai negatif tersebut menandakan adanya penurunan aktivitas enzim amilase yang dihasilkan. Ada beberapa hal yang menyebabkan penurunan aktivitas enzim, diantaranya karena adanya proses awal  perkecambahan  diperlukan energi yang cukup besar, untuk itu diperlukan enzim amilase yang banyak untuk merombak karbohidrat. Setelah waktu tertentu, fase perkecambahan akan dialihkan menjadi fase pertumbuhan, sehingga pembentukan enzim amilase menjadi menurun (Bahri, 2012). Selain itu, dimungkinkan kondisinya tidak sesuai (terlalu asam atau basa) sehingga interaksi antara enzim dan substrat menjadi kurang maksimal. Pada suasana yang terlalu asam atau basa, konformasinya berubah sehingga aktivitas enzim terganggu (Mappiratu, 2009).

Pada pengujian aktivitas enzim amilase ini, ada beberapa faktor yang memengaruhi, yaitu sebagai berikut:

1.      Suhu: karena enzim adalah suatu protein maka kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi dan bagian aktif enzim terganggu sehingga konsentrasi dan kecepatan enzim menurun

2.      pH: umumnya efektivitas maksimal enzim pada pH 4,5-8. Pada pH terlau tinggi atau rendah umumnya enzim menjadi non aktif secara irreversible karena denaturasi protein.

3.      Konsentrasi enzim: pda konsentrasi substrat tertentu kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim

4.      Konsentrasi subtrat: umumnya konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi, akan tetapi pada batas tertentu tidak terjadi peningkatan kecepatan reaksi walau konsentrasi substrat diperbesar.

Adanya zat penghambat: hambatan/ inhibitor suatu reaksi berpengaruh terhadap penggabungan substrat pada bagian aktif yang mengalami hambatan.

Kesimpulan

            Ada beberapa poin kesimpulan dari percobaan ekstraksi dan uji aktivitas enzim amilase diantaranya adalah

1. Prinsip percobaan ini adalah menguji aktivitas enzim amilase dari kecambah biji-bijian dimana aktivitas enzim amilase ditunjukkan dan diukur dari banyaknya maltosa yang terbentuk setelah substrat pati diinkubasi dengan enzim amilase.
2. Tujuan dari percobaan ini adalah mengisolasi enzim amilase dari kecambah kacang hijau dan untuk menguji aktivitas enzim yang telah diekstrak.
3. Berdasarkan data hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim amilase dari yang terkecil ke terbesar adalah biji direndam 12 jam < biji dikecambah 12 jam < biji dikecambah 24 jam < biji yang dikecambah 48 jam < biji kering. Hal ini tidak sesuai dengan literatur, karena terdapat kesalahan penghancuran biji yang kurang halus, sehingga enzim dalam biji kacang hijau tidak terekstraksi keseluruhan.

Ada beberapa faktor yang memengaruhi dalam percobaan ekstraksi dan uji aktivitas enzim amilase, yaitu suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat dan adanya inhibitor.

Daftar Pustaka

Bahri, Syaiful. 2012. Karakterisasi Enzim Amilase dar Kecambah Biji Jagung Ketan. Palu: FMIPA Universitas Tadulako.

Bergmeyer, Hans-Ulrich. 2010. Methods of Enzymatic Analysis. New York: Academic Press.

Mappiratu dan Nurhaeni. 2009. Penuntun Praktikum Enzim Pangan. Palu: Jurusan Kimia FMIPA Universitas Tadulako.

Muljoharjo, Muchji. 2008. Analisis Pati dan Produk Pati. Yogyakarta: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi UGM.

Suarni. 2007. Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai Sumber Enzim alfa-amilase. Makasar: FMIPA Universitas Hasanudin.

Tim penyusun, dkk. 2006. Buku petunjuk Praktikum Biokimia dan Enzimologi. Malang: FTP Universitas Brawijaya.